一、PCR實驗室的清潔消毒
(1)PCR實驗室應設置試劑貯存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增反應混合物和擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)4個工作區(qū)城,4個區(qū)域必須是相互獨立的,不能直通,應有緩沖間供工作人員換工作服和鞋,并且有明確的標志,進入各工作區(qū)域嚴格按照從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應混合物和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)單一方向進行。
(2)各區(qū)有完善的相應設備,儀器設備和所有物品必須嚴格分開,不得混用,不同的工作區(qū)域使用不同顏色的工作服.工作人員離開時不得將工作服帶出。在整個PCR實驗操作過程中,工作人員都必須戴上手套,并經(jīng)常更換,還要求工作人員戴口罩,避免在處理樣本時對人體造成污染,保證工作人員的身體安全。每次實驗前應作好吸嘴Eppendorf管、反應管和加樣器等物品的高壓消毒,各工作區(qū)域的地面用10%次氯酸鈉消毒,打開排風扇使各區(qū)的空氣流通。
(3)試劑貯存和準備區(qū):貯存試劑的制備、試劑分裝和主反應混合液的制備都應在該區(qū)完成。貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區(qū),不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi),并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后,應將其分裝貯存?zhèn)溆帽苊庥捎诮?jīng)常打開反應管吸液而造成污染。目前本科室使用的試劑盒反應液是廠家配好的,單人單管只需從此區(qū)移至下一個工作區(qū)域。工作結東后必須立即對工作區(qū)域進行清潔消毒,實驗室的桌椅表面每次工作后也要清潔,實驗室的空氣消毒打開房項的紫外燈照射。
(4)標本制備區(qū):標本處理對核酸擴增有很大影響,必須使用有效的提取方法,選擇好的試劑品牌是一個很關鍵的問題,試劑質(zhì)量的好壞直接影響到實驗結果的準確性。臨床標本都集中在本區(qū),實驗操作過程中一定要嚴格按照實驗室操作流程,特別在加樣中,空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠污染,所以應避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動,為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應混合液的反應管,防止溶液外濺。工作結束后必須立即對實驗臺表面、加樣器、有機玻璃試管架,離心機,首先用10%次氯酸鈉消毒,然后用70%乙醇清潔,另外,實驗臺表面使用254nm波長可移動紫外燈,距離實驗臺上60~90 cm內(nèi)長時間照射照射過夜更好。用過的吸嘴必須放人專用的含次氯酸鈉溶液的容器內(nèi)浸泡,實驗室的桌椅表面每次工作后也要清潔,實驗室的空氣消毒同樣打開房頂?shù)淖贤鉄粽丈洹?/span>
(5)擴增區(qū):DNA擴增不能從本區(qū)再進人任何“上游”區(qū)城,以避免氣溶膠從本區(qū)漏出,本區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源,因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。本區(qū)工作后的清潔消毒和紫外燈照射方法與前面區(qū)域相同。
二、PCR實驗室的防污染措施
(1)污染原因:①擴增產(chǎn)物污染:這是 PCR反應中最主要也是最常見的污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大,遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以,極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽性。實驗材料如重組克隆的DNA或者來自同一次PCR的擴增產(chǎn)物污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣器,容器及其他溶液被PCR核酸模板污染。②測試樣品污染:收集標本的容器被污染或標本放置時由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于加樣器污染導致標本間污染;尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。③氣溶膠污染:最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較刷烈地搖動反應管開蓋時、吸樣時及污染加樣器的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆??珊?/span>48 000拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。另外,實驗室的環(huán)境、試劑及任何與擴增產(chǎn)物接觸的東西,都是污染的來源。
(2)防污染措施:PCR 實驗室嚴格分區(qū):將實驗室分為4個工作區(qū)域并嚴格按照從試劑貯存和準備區(qū)→標本制備區(qū)→擴增反應混合物和擴增區(qū)→擴增產(chǎn)物分析區(qū)單一方向順序進行。各區(qū)必須相互獨立,儀器設備和各種物品嚴格分開,不能串用。分裝PCR試劑:當使用的PCR試劑盒,不是獨立分裝的反應液時,應將PCR反應液預先配制好。然后分裝到反應管-20℃保存,以減少重復加樣次數(shù),避免污染機會。PCR試劑、PCR反應液與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,試劑盒電面的陽性對照、陽性參考品也應該與試劑分開放置,不應放于同一冰箱。正確使用加樣器:吸樣時要特別小心應緩慢勻速,避免液體濺到加樣器頭上,盡量一次性吸完,忌反復多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠。打出液體后拇指不應松開按鈕,將吸嘴壓掉后冉將拇指松開,避免液體回吸。實驗前后按要求作好實驗室的清潔消毒工作,特別是實驗完成后,消毒工作一定要徹底,破壞殘留的DNA防止操作人員污染,使用一次性手套,吸嘴、Eppendorf管和反應管也應該一次性使用。Eppendorf管的質(zhì)量也不容忽視,好質(zhì)量的(有齒輪)Eppendorf管,管蓋密封嚴實,避免樣本外溢和外來核酸的進入。打開之前應先離心,將管壁和管蓋上的液體甩至管底開蓋時動作要輕以防管內(nèi)液體濺出,造成污染。應設陽性對照和陰性對照,選擇拷貝在臨界值的弱陽性作陽性對照,并注意交叉污染的可能性,每次實驗都應有一管不加模板的試劑對照,以監(jiān)測試劑是否污染,還應帶一個不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。
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